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在这一阶段,上述小分子的化合物在发酵细菌(即酸化菌)的细胞内转化为更为简单的化合物并分泌到细胞外。这一阶段的主要产物有挥发性脂肪酸(简写为VFA)、醇类、乳酸、二氧化碳、氢气、氨、硫化氢等。与此同时,酸化细菌也利用部分物质合成新的细胞物质,因此未经酸化废水厌氧处理时会产生更多的剩余污泥。酸化菌对pH有很大的容忍性,产酸可在pH到4的条件下进行,产甲烷菌则有它自己的pH:6.5~7.5,超出这个范围则转化速度将减慢。
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